[资料] 大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
  2.仪器设备与器具：
  2.1 恒温培养箱：36±1℃。
  2.2 1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管。
  2.3 接种针。
  2.4 显微镜。
  2.5 超净工作台。
  2.6 玻片、酒精灯、洗耳球、试管架。
  2.7 天平：感量0.01g。
  2.8 灭菌釜。
  2.9 培养皿（直径为90mm）、试管，经121℃、30分钟灭菌。
  2.10试管夹、酒精灯、秒表、载玻片 3.培养基及试剂：
  3.1 乳糖胆盐发酵管：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。
  3.2 伊红美兰琼脂平板： 按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。
  3.3 乳糖发酵管： 按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。
  3.4 革兰氏染色液。
  3.4.1 结晶紫染色液：
  结晶紫 1g
  95%乙醇 20ml
  1%草酸铵水溶液 80ml
  将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
  3.4.2 革兰氏碘液：
  碘 1g
  碘化钾 2g
  蒸馏水 300ml
  将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 ml。
  3.4.3 沙黄复染液：
  沙黄 0.25g
  95%乙醇 10ml
  蒸馏水 90ml
  将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
  3.5 生理盐水。
  4.检验程序：
  检样
  ↓
  稀释
  ↓
  乳糖胆盐发酵管，36±1℃，24±2hr
  
  ↓ ↓
  不产气 产气
  ↓ ↓
  大肠菌群阴性 伊红美兰琼脂平板，36±1℃，24±2hr
  ↓
  报告 ↓ ↓
  革兰氏染色 乳糖发酵管，36±1℃，24±2hr
  ↓
  ↓ ↓ ↓ ↓
  G+ G-，无芽孢杆菌 产气 不产气
  ↓ ↓
  大肠菌群阴性 大肠菌群阴性
  ↓ ↓ ↓
  报告 大肠菌群阳性 报告
  
  5.测定方法：
  5.1 检样稀释：
  5.1.1 以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中，经充分振摇成1：10均匀稀释液。
  5.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的 试管中，振摇成1：100稀释液。
  5.1.3 重复5.1.2的操作，使成1：1000稀释液。
  5.2乳糖胆盐发酵试验：根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择二个稀释度，每一稀释度接种3管，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管。1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。然后置于36±1 ℃培
  养箱内，培养24±2hr，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌
  群阴性；如有产气者，则可按以下程序进行。
  5.3分离培养：将产气的发酵管分别接种于伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养24hr后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色。
  5.4证实试验：在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃温箱内培养24±2hr，观察产气情况。乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
  5.5报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。

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